PCR诊断有关的问题

版主按：性病是一组感染性疾病，也就是说：是由致病性微生物引起的疾病。对于这类疾病，分离、培养、鉴别致病微生物是以往诊断的“金标准”，而且，培养时还可以同时做药物敏感试验，指导临床使用抗菌素。但是，在临床上一直存在一些问题，如培养时间过长；部分致病菌培养困难；敏感性及特异性不高等。随着医学科学技术的发展，尤其是分子生物学的迅速发展，非培养的实验室检查技术得到了令人瞩目的成就，尤其是以PCR（聚合酶链反应）为代表的检查技术得到了极大的发展。但是，在国外，他们并不是常规检查项目，而在国内，在性病实验室检查中，却普遍开展。究竟他们在实际临床应用中的效果如何？其可靠性、特异性、敏感性如何？一直受到医学界的关注，也有网友来信咨询。在最新一期的《中国皮肤性病学杂志》（2002年1月）上，刊登了中国科学医学院中国协和医科大学皮肤性病研究所（中国最高等级的皮肤性病研究所）叶顺章教授等研究的论文《PCR检验技术在性病临床标本实验诊断中应用价值的研究》，对此进行了深入的研究（有兴趣的人士可以查看本页的后面）。其研究的主要结论与斑竹的看法一致，即：

1、用PCR法检查性病患者的临床标本检查致病微生物，其敏感性和特异性均比传统的培养法高。有巨大的应用潜力。

2、作PCR试验的标本取材要求不如作培养那样严格，克服了一些培养法存在的缺点，如培养时间太长等。

3、作PCR应使用正规的试剂盒、规范的操作和严格的防污染措施，否则极易引起交叉污染。影响PCR结果的因素众多。标本的前处理方法及操作的环境的净洁度十分重要。不同引物对试验结果也有影响。

4、PCR的实验操作，需要专门人员，结果的判读，需要专门训练过的人员。否则可能会出现偏差。

5、PCR不宜用作为性病治愈判定标准，病人经治疗后病菌死亡、症状消失即可判为治愈，如果要等体内死菌也全部排完（PCR转阴），势必造成过度治疗。也不能够做药物敏感试验。

6、国内目前尚无正规的试剂和规范的规程，前2年卫生部曾因此下文暂停在性病临床检验中使用PCR试验。

PCR检验技术在性病临床标本

实验诊断中应用价值的研究

　                      中国医学科学院中国协和医科大学皮肤病研究所

                           叶顺章，王千秋，王荷英，李珊山，张树文

[摘要] 目的 评价聚合酶链反应（PCR）检测技术在性病临床诊断中的应用价值。方法 比较PCR与传统检测手段对淋病和非淋菌性尿道炎病原体的检测结果。淋球菌以加多粘菌素的 GC血液琼脂分离；衣原体用 McChy细胞培养；支原体用高效支原体培养基培养。PCR试验用基因释放剂作前处理，以1.5％琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果 用PCR法检查淋病、衣原体和支原体感染的临床标本其敏感性和特异性均比传统的培养法高，作PCR试验的标本取材要求不如作培养那样严格，但作PCR应使用正规的试剂盒、规范的操作和严格的防污染措施，否则极易引起交叉污染。结论 PCR检验技术在性病诊断中具有巨大的应用潜力，对一些培养困难的病原菌，可在规范操作和标准化试剂盒的基础上逐步加以使用。PCR检测不宜用作判愈。

聚合酶链反应（PCR）是1985年才建立起来的一种体外DNA扩增试验。其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在下，在DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增延伸。由于试验的敏感性和特异性高，对标本采集的要求远不如培养那么严格，使它在医学领域得到了广泛的应用。但是作PCR需要标准化的试剂和严格的防污染措施，否则由于交叉污染等原因极易产生假阳性反应。本文以淋病及非淋菌性尿道炎（NGU）病原菌为检测对象，用PCR与传统检测手段进行比较，以评价PCR检测技术在性病临床标本实验诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本的采集 所有标本取自我所医院性病门诊病人。患者均有非婚性交史及不同程度的泌尿生殖道症状。女病人中部分因配偶患性病而来就诊。

取材方法按常规操作。即男性患者由尿道口内3cm处、女性患者由宫颈口内1～1.5cm处取材。棉拭插至取材处后，转动并停留数秒种。第1个拭子作病原体分离，第 2个拭子取后洗于 1 ml等渗盐水，－20℃冰箱保存，作PCR测定用。

1.2 菌株及其来源 淋球菌标准株WI、WⅡ、WⅢ由美国疾病控制中心提供；作对照用的其它淋球菌、脑膜炎双球菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等由军事医学科学院微生物流行病学研究所提供；痢疾杆菌、变形杆菌、结核杆菌和大肠杆菌由本所保存；衣原体标准株H、D、J、K型由我所保存，其它血清型标准株由加拿大Sherbrooks大学Frost博士赠送；解脲衣原体、人型支原体、肺炎支原体、发酵支原体、唾液支原体、口腔支原体和精氨酸支原体由首都儿科研究所提供。

1.3 培养基 培养淋球菌用加多粘菌素的GC血液琼脂；衣原体用McCoy细胞作微量板细胞培养；支原体用我所生产的高效支原体培养基培养。支原体培养基的主要成分是在基础培养基中加入10％小牛血清、10％酵母浸液、0.1一0.15％尿素、0.02％酚红和500U～10 00μ／ml青霉素。支原体固体培养基是在上述成分基础上加入1％琼脂粉。

1.4 PCR试验 根据基因库所提供的淋球菌、衣原体和解脲衣原体的基因序列，采用国内PCR设计软件或参照Mohony和Frost等方案设计引物。试验经变性、退火、延伸等步骤最后取20μl反应产物加4μl电泳指示液（溴酚蓝0.25％，蔗糖40％）后，在1.5％琼脂糖凝胶上作电泳。用手提式紫外灯随时观察电泳结果并照相。为避免繁琐的标本前处理过程，在标本加到PCR反应管后立即加入基因释放剂（gene releaser）10μl。

2 结果

2.1 根据淋球菌染色体随机克隆片段ORF-1基因序列设计了一对引物，能特异地对所有血清型淋球菌扩增出预期的461bp片段，而对其它菌无反应。采用PCR和培养法对57份临床标本进行检测，结果如表l。如以培养为金标准，则PCR的敏感性为97.1％，特异性为 91.3％，阳性预期值为95.5％。

表1 PCR法和培养法检测临床标本中淋球菌的结果 例

对淋球菌菌悬液作梯度稀释后检测，发现该PCR最高灵敏度是检出30个淋球菌。

2.2 参照MOhony等的设计合成了针对沙眼衣原体隐蔽性质粒的引物，扩增片段为241bp。对400份性病门诊患者标本同时用细胞培养法和PCR进行检测。对培养阴性但PCR阳性者，再用沙眼衣原体主要外膜蛋白1（ompl）基因引物PCR作进一步检测，后者亦阳性者判为真阳性。结果如表2

表2 PCR法与细胞培养法检测临床标本中沙眼衣原体的结果 例

5份培养阴性质粒PCR阳性的标本中有4份omp1.PCR亦阳性。以此计算，培养和PCR敏感性分别为87.9％和97.0％，特异性分别为100％和99.7％。PCR的阳性预期值为96.7％，阴性预期值为99.7％。

2.3 根据解脲衣原体尿素酶基因序列设计了一对引物。两条引物各为20个核苷酸，扩增片段为283bP。用限制性内切酶Hinc Ⅱ对产物进行酶切，可得到预期的151和132二条片段。用PCR法和培养法检测了118例性病门诊患者尿道或宫颈分泌物标本，结果如表3。

表3 118例性病患者用2种方法检测的结果 例

由表 3可见， PCR阳性率为32.2％，培养法阳性率为28.0％。用配对计数资料X^{2检验分析表明两法结果差异无显著性（X2=0.5， P＞0.05）。若以培养法为“金标准”，则PCR的敏感性为100％，特异性为94.1％。}

^{2.4 选择34例淋病患者，观察2种方法检查淋球菌转阴时间。治疗前淋球菌培养及PCR检测均为阳性。治疗后，每周进行培养和PCR检测1次，直至2次阴性才停止检查。结果，用淋球菌培养全部34例患者在治疗后1周已转为阴性，而用PCR检查33例为阴性。有1例女性患者在治疗后3天症状已消失，到1周时培养已阴性，但PCR检测直至第2周才转为阴性。结果见表4。}

^{表4 2种方法检查淋球菌阴转时间 例}

^{2.5 影响PCR结果的因素}

^{25.1 不同PCR试剂盒对阳性率的影响 我们选择了2种不同引物的PCR试剂盒来检测标本中的沙眼衣原体。引物1扩增片段为225bp、引物2为473bp。共检查220份临床标本，结果如表5。两引物检测结果的阳性数有差异，但在统计学上差异无显著性（（X2=0.45， P＞0.05）。}

^{表5 不同引物检测临床标本中沙眼衣原体的比较}

^{2.5.2 标本处理方法 比较2种不同的标本前处理方法。方法1采用非离子去污剂，方法2采用基因释放剂。检测34份淋病病人标本。结果表明用方法1检查时仅3份阳性，而用方法2时则有33份阳性。说明标本的前处理过程对PCR检测结果有重要影响。}

^{2.2.3 不同操作环境对PCR结果的影响 比较了在不同操作环境下用同样的PCR试剂和方法对120份衣原体标本的PCR检测结果。环境1：标本的处理及加样均在无菌操作柜中进行；环境2：标本的处理及加样在普通实验室内进行，通风条件一般，未作紫外线灭菌；环境3：标本的处理、加样、PCR反应和判读结果均在同一较小室内进行，条件较差。结果，120份临床标本在3种环境条件下阳性率均为 12％，但在环境2、环境3下，PCR产物电泳时，均出现了一些非特异性的条带。这些条带和阳性条带虽有区别，但如观察者缺乏经验，可能会将其误认为阳性条带。}

^{3 讨论}

^{在理想的条件下，PCR法对临床标本中常见的病原体的检测有较高的敏感性和特异性，本文通过对数百份标本的检测，证明PCR对临床标本中淋球菌、衣原体和支原体的检查比常规的培养法要敏感得多。但做PCR需要有批号的试剂盒和规范的操作，否则极易产生交叉污染而得出错误的结果。前2年卫生部出于国内尚无正规的试剂和规范的规程，曾下文暂停在性病临床检验中使用PCR试验。但是PCR试验本身仍不失是一种好的检测方法，相信通过清理和整顿，逐步开放一些难培养的病原体的PCR试验是必要的。}

^{由于PCR敏感性高，检查的是死菌，因此，对采集标本的要求并不那么严格，现已有用病人的尿沉渣和几个病人的尿液混合后（发现阳性再分别做）作PCR的报道，这种非侵入性的取材方法颇受患者的欢迎。但是PCR不宜用作判愈，病人经治疗后病菌死亡、症状消失即可判为治愈，如果要等体内死菌也全部排完（PCR转阴），势必造成过度治疗。}

^{影响PCR结果的因素众多。标本的前处理方法及操作的环境的净洁度十分重要。不同引物对试验结果也有影响，但由于我们只比较2种引物，尚未见到它们之间的差别。文献报告针对不同基因或相同基因不同顺序的引物，PCR的敏感性和特异性可以相差很大。目前观察PCR的结果常采用琼脂糖凝胶电泳法，人为因素影响较大。今后在临床应用时，应该向酶标杂交法等较客观的判定方法发展。}